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    本發明之具體實施例揭示一種用於偵測一目標物的生物感測器。一示例性感測器包括一第一電極。該第一電極包括一第一電子傳導分子與一第一探針。該第一探針包括一第二電子傳導分子。該第一探針配置成來結合存在溶液中該特定的目標物。該等第一與第二電子傳導分子不相同。
    公开号:TW201300779A
    申请号:TW101116361
    申请日:2012-05-08
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Shi-Ming Lin；Bor-Ching Sheu；Luan-Yin Chang；Chih-Chen Lin
    申请人:Univ Nat Taiwan；
    IPC主号:G01N33-00
    专利说明:
    生物感測器
    本發明係關於一種生物感測器，尤指一種用於偵測像是生物分子的目標分子之分析裝置。
    生物感測器為一種分析裝置，用於偵測像是生物分子的目標分子。大多數生物感測器為光學生物感測器。光學生物感測器可以包括金屬薄膜，其能夠與光線相互作用，並在該金屬薄膜表面上產生電磁波。該等電磁波會在入射光線的一特定角度與一特定波長之下發生，因此高度相關於該金屬薄膜的表面。當一生物分子附著在該金屬薄膜上時，可產生一可測量的信號。
    某些生物感測器為電化學式生物感測器。電化學式生物感測器通常使用觸媒或酵素做為探針。但是，這種電化學式生物感測器的應用因為該信號基本上較低即受到限制。因此需要具有較高的信號對雜訊比之新型生物感測器來準確地偵測特定的目標分子。
    本發明之一些具體實施例概略關於用於偵測一目標物的感測器。一示例性感測器可包括利用一第一電子傳導分子處理過的電極，及一結合有一第二電子傳導分子的探針。該探針附著於該第一電極，並配置成來結合該目標物。該等第一與第二電子傳導分子可以不同。
    本發明之另一些具體實施例概略關於用於偵測一目標物的方法。一示例性方法可包括將如上述的一種感測器與可能包含該目標物的一樣本接觸。當該目標物結合到該探針時，即產生一信號。當偵測到該信號時，此代表該目標物存在於該樣本中。
    本發明之額外具體實施例概略關於一種結合於一電子傳導分子的探針，例如一抗體。這種抗體分子可用於如此處所述之感測器中。一示例性抗體結合一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物。亦提供一種包含結合於一電子傳導分子之探針的電極，例如結合於一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物之抗體。
    前述的摘要僅為例示性質，其並非以任何方式做為限制。除了前述該等例示性態樣、具體實施例與特徵之外，其它的態樣、具體實施例與特徵將可參照該等圖式與以下的實施方式而更加瞭解。
    在以下的詳細說明中，係參照該等附屬圖式，其形成為說明的一部份。在該等圖式中，類似的符號基本上代表類似的組件，除非另有指明。在實施方式、圖式與申請專利範圍中所述之該等例示性具體實施例並非為限制性。可利用其它具體實施例，並可進行其它變化，其皆不背離此處所提出之標的之精神或範圍。應可立即瞭解到本發明之該等態樣，如此處概略所述、如該等圖式中所示者，其可用許多不同組態來配置、取代、組合與設計，其皆被明確地考慮過，並構成本發明的一部份。
    在本發明中，術語「電子傳導分子」(Electron conducting molecule)概略代表一種傳導電子的化合物。該電子傳導分子可以提供重疊p軌域的區域，其可允許π電子的去區域作用橫跨相鄰的對準p軌域。一電子傳導分子的傳導性可利用傳導原子力顯微鏡來檢視。在一些具體實施例中，一電子傳導分子可在如此處所述之生物感測器的晶片中之傳導性於施加大約0.01伏特電壓時大約1 μΩ-1到大約10 μΩ-1。
    該術語「探針」(probe)概略代表一種能夠與一特定之目標物(例如生物分子)結合的化合物。例如，結合一目標物至探針上可具有大約100微微牛頓(piconewtons)至大約500微微牛頓的親和力。探針之非限制性示例包括抗體、抗體片段，此片段可保持有能力來結合至該特定的目標物、核酸(例如去氧核醣核酸DNA、核醣核酸RNA)、適體(aptamer)、抗原(antigen)與酵素(enzyme)。
    該術語「目標物」(target)概略代表一種可利用如此處所述之生物感測器偵測到的任何分子。一目標物可包括但不限於一生物分子。可在此處所述之生物感測器中偵測到的目標物之示例包括但不限於生物分子(例如自由的或存在於病毒細菌細胞表面的蛋白質、核酸、碳水化合物及脂質)，及其它種類的小分子，例如脂肪酸、半抗原(hapten)與毒素。
    此處所述之探針可以包含一電子傳導分子。該探針之電子傳導行為可以利用該電子傳導分子所提供的該等重疊p軌域而被引發。因此，當一目標物結合至該探針時，伴隨於該目標物與該探針之結合的一電場變化可被放大。
    在一些具體實施例中，用於偵測一生物分子的感測器包括一第一電極、一第一探針、及第一與第二電子傳導分子。該第一探針識別並結合在一樣本中一特定的目標物。在一些具體實施例中，該等第一與第二電子傳導分子不相同。該第一電極利用該第一電子傳導分子做處理。該第一電子傳導分子可直接或經由聯結子分子形成與該第一電極的一第一化學鍵結。該第一化學鍵結可為一共價鍵。在一些具體實施例中，該第一探針可以與該第一電極形成一化學鍵結，例如一共價鍵。
    在一些具體實施例中，該第一探針利用一第二電子傳導分子做處理。在一些具體實施例中，該第二電子傳導分子結合於該第一探針，例如直接或經由一聯結子分子共價地結合於該第一探針。在一些具體實施例中，該第一探針可以與該第一電子傳導分子形成一第二化學鍵結。因此，該第一探針可經由該第一化學鍵結與該第二化學鍵結而附著至該第一電極，且亦可包含一附著的第二電子傳導分子。
    該第一探針可以與要由該感測器偵測的該目標物形成一「鎖與鑰匙」的關係。例如，該第一探針可為DNA、RNA、蛋白質、抗體、抗體片段、適體、抗原或酵素。在一些具體實施例中，該第一探針為一抗體，且該目標物為該抗體可與之結合的一抗原。當可能包括該目標物的一第一樣本被引入到該感測器中，然後流動在該第一電極之上時，伴隨於該第一電極的一第一電場即回應於該目標物結合至該第一探針而改變。一第一信號基於該改變的第一電場而得到。該感測器可以包含配置成偵測該第一信號的一處理器。在一些具體實施例中，偵測到該第一信號代表該第一樣本包含該目標物。藉由利用該第二電子傳導分子處理該第一探針，例如附著該第二電子傳導分子至該第一探針，該第一探針的電傳導性即增加。因此，當該目標物結合至該探針時，關聯於該結合的該電場變化被更快地偵測到。在某些具體實施例中，該感測器包含一第一流動通道，其係接觸於該第一電極，且被懷疑可能包含該目標物的一第一樣本即流動通過其中，且其中當該目標物結合至該第一探針時即產生一信號的改變。
    在一些具體實施例中，該感測器包括一第二電極，其包含一第三電子傳導分子與一第二探針。該第二探針配置成並不耦合於要由該感測器偵測的該目標物。在一些具體實施例中，該第二探針對於該目標物之結合親和力小於約50微微牛頓或其結合常數小於約10-3 M。該第三電子傳導分子可以相同或不同於該第一或第二電子傳導分子。在一具體實施例中，該第三電子傳導分子相同於該第一電子傳導分子。
    在一些具體實施例中，該第三電子傳導分子與該第二電極形成一第三化學鍵結。該化學鍵結可為一共價鍵。在一些具體實施例中，該第二探針可以與該第二電極形成一化學鍵結。該化學鍵結可為一共價鍵。
    在一些具體實施例中，該第二探針包含一第四電子傳導分子，其可相同或不同於該第一或第二電子傳導分子，且其可相同或不同於該第三電子傳導分子。在一具體實施例中，該第三電子傳導分子經由該第三化學鍵結而附著(例如直接或經由聯結子分子共價鍵結)至該第二電極，該第二探針經由一第四化學鍵結而附著(例如為共價地附著)至該第三電子傳導分子。該第四電子傳導分子可附著(例如共價地附著)至該第二探針。例如，該第二探針可經由該第三化學鍵結與該第四化學鍵結而附著至該第一電極，且亦可包含一附著的第四電子傳導分子。
    該第二探針可以與要由該感測器偵測的該目標物不相同的一生物分子形成一「鎖與鑰匙」的關係。在一些非限制性具體實施例中，該第二探針可為DNA、RNA、蛋白質、抗體、抗體片段、適體、抗原或酵素。在一些具體實施例中，該第二探針為一種抗體，其可識別要被偵測的該目標物之外的抗原。
    在一些具體實施例中，該感測器包含接觸於該第一電極的一第一流動通道，及接觸於該第二電極的一第二流動通道。該感測器可配置成使得懷疑可能包含該特定的目標物之第一樣本同時流動通過該第一流動通道與該第二流動通道，或者另外可配置成使得該第一樣本非同時地流動通過該等第一與第二流動通道。一第一信號於該第一流動通道中產生，如上所述。關聯於該第二電極的一第二電場回應於該第一樣本而改變。一第二信號基於該改變的第二電場而被產生。該第一信號與該第二信號可被記錄來進一步處理。
    在一些具體實施例中，實質上並無該特定的目標物之一第二樣本分別經由該第一電極與該第二電極被引入到該感測器當中。一第三信號回應於該第二樣本流動通過該第一電極而在該第一流動通道中產生。一第四信號回應於該第二樣本流動通過該第二電極而在該第二流動通道中產生。基於該第一信號與該第三信號之間的一第一差異與該第二信號與該第四信號之間的一第二差異的比例，該感測器可判定該目標物是否存在於該第一樣本中。
    在一些具體實施例中，所提供的一生物感測器包含至少兩個電極，其中一個電極包含至少一探針與一電子傳導分子，而另一個電極包含至少一探針與一個電子傳導分子。
    在一具體實施例中，所提供的一種生物感測器包含：(a)一第一電極，其包含如此處所述之一第一探針及如此處所述之一第一電子傳導分子及第二電子傳導分子，其中該第一探針配置成以結合至在一樣本中一特定的目標物；及(b)一第二電極，其包含一第三電子傳導分子，及包含一第四電子傳導分子的一第二探針，其中該探針不會結合至該特定的目標物。這種生物感測器可用於如此處所述之一種用於偵測特定的一目標分子的方法。
    在一些具體實施例中，該等第一、第二、第三及/或選擇性的第四電子傳導分子可為一芳香族化合物、一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一噻吩化合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或它們的衍生物之一。一些示例性電子傳導分子包括但不限於3-(唑吩-2-基)丙醛、3-苯基丙醛、3-(1-吡咯-2-基)丙醛、3-(吡啶-2-基)丙醛、(E)-4-苯基丁-3-烯醛、(E)-4-(4-(E)-苯乙烯基苯基)丁-3-烯醛、(E)-4-(吡啶-2-基)丁-3-烯醛、(E)-4-(5-((E)-2-(吡啶-2-基)乙烯基)吡啶-2-基)丁-3-烯醛、(E)-庚-4,6-二烯醛、(Z)-庚-4,6-二烯醛、(E)-4-(亞環己-2-烯基)丁醛、2-(萘-2-基)乙醛、5”-甲醛-5-羧基-2,2’,5’,2”-三聯噻吩、對-4’-甲醛-4-羧基-1,1’-聯苯、5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩及它們的衍生物之一。
    在一些具體實施例中，係揭示一種用於偵測一目標物的方法。該方法包括將上述之任何的感測器接觸於被懷疑包含該目標物的一第一樣本，並當該目標物結合至該第一探針時偵測如上述之一第一信號。在一些具體實施例中，偵測到該第一信號代表該目標物存在於該第一樣本中。視需要，一第二信號、一第三信號與一第四信號如上所述地被偵測到，且該第一、第二、第三與第四信號被處理來判定該目標物是否存在於該第一樣本中。
    在一些具體實施例中，該方法包括利用一第一電子傳導分子處理一第一電極，將一第一探針結合於一第二電子傳導分子，並附著該第一探針在該第一電極上。該第一探針配置成來與該目標物結合。
    該方法另可包括利用相同的第一電子傳導分子處理一第二電極，並附著一第二探針在該第二電極上。該第二探針配置成不會結合至該目標物。
    該方法另可包括引入可能包括該目標物的一第一樣本來同時流動通過該第一電極與該第二電極，以分別得到一第一信號與一第二信號。該方法另可包括引入實質上並無該目標物的一第二樣本來同時流動通過該第一電極與該第二電極，以得到一第三信號與一第四信號。該方法另可包括基於該第一信號、第二、第三與第四信號的定量判定該第一樣本是否包括該目標物，如上所述。
    圖1為一種用於偵測一特定的目標物之感測器100的例示性具體實施例。感測器100包括一緩衝溶液桶101、一泵103、一分離器105、一第一樣本迴路130、一第二樣本迴路140、一生物晶片120、一廢液桶109與一處理器108。第一樣本迴路130與第二樣本迴路140配置成儲存可能包括要由該感測器偵測的一目標物之一樣本。在該感測器被啟動之後，泵103汲取儲存在緩衝溶液桶101中的一緩衝溶液，以沖洗第一樣本迴路130與第二樣本迴路140。然後該樣本存在於該緩衝溶液，並由一第一通道111與一第二通道113流動通過生物晶片120。生物晶片120包括一第一電極組121與一第二電極組122。該樣本在該樣本流動通過生物晶片120之後最終被收集在一廢液桶109中。
    一第一探針可被附著至第一電極組121上，且該第一探針配置成來結合要被感測器100偵測的該目標物。一第二探針可被附著至第二電極組122上，且該第二探針配置成不會與要被感測器100偵測的該目標物結合。
    當該樣本流動通過第一電極組121與第二電極組122，第一電極組121與第二電極組122之電場可分別改變。然後反應出第一電極組121與第二電極組122的電場變化之該等信號可經由電路123、124被傳送至電訊號處理器108來進一步處理。處理器108配置成判定要由該感測器偵測到的該目標物是否存在於該樣本中。
    圖2所示為一種用於偵測生物分子的方法200之例示性具體實施例的流程圖。方法200包括步驟201、203與205。在步驟201中，一電極可利用一第一電子傳導分子來處理。該第一電子傳導分子可與該第一電極直接或經由聯結子分子形成一共價鍵。該電極可為金屬，例如金、白金、銀、銅、鎢等等。一些示例性第一電子傳導分子包括但不限於3-(噻吩-2-基)丙醛、3-苯基丙醛、3-(1-吡咯-2-基)丙醛、3-(吡啶-2-基)丙醛、(E)-4-苯基丁-3-烯醛、(E)-4-(4-(E)-苯乙烯基苯基)丁-3-烯醛、(E)-4-(吡啶-2-基)丁-3-烯醛、(E)-4-(5-((E)-2-(吡啶-2-基)乙烯基)吡啶-2-基)丁-3-烯醛、(E)-庚-4,6-二烯醛、(Z)-庚-4,6-二烯醛、(E)-4-(亞環己-2-烯基)丁醛、2-(萘-2-基)乙醛、5”-甲醛-5-羧基-2,2’,5’,2”-三聯噻吩、對-4’-甲醛-4-羧基-1,1’-聯苯、5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩，及它們的衍生物之一。
    在步驟203中，一探針與一第二電子傳導分子結合。該探針可為DNA、RNA、蛋白質、抗體、抗原或酵素。該第二電子傳導分子可以不同於該第一電子傳導分子。一些示例性第二電子傳導分子包括但不限於3-(噻吩-2-基)丙醛、3-苯基丙醛、3-(1-吡咯-2-基)丙醛、3-(吡啶-2-基)丙醛、(E)-4-苯基丁-3-烯醛、(E)-4-(4-(E)-苯乙烯基苯基)丁-3-烯醛、(E)-4-(吡啶-2-基)丁-3-烯醛、(E)-4-(5-((E)-2-(吡啶-2-基)乙烯基)吡啶-2-基)丁-3-烯醛、(E)-庚-4,6-二烯醛、(Z)-庚-4,6-二烯醛、(E)-4-(亞環己-2-烯基)丁醛、2-(萘-2-基)乙醛、5”-甲醛-5-羧基-2,2’,5’,2”-三聯噻吩、對-4’-甲醛-4-羧基-1,1’-聯苯、5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩及它們的衍生物之一。
    在步驟205中，該探針被附著在該電極上。該探針可與該第一電子傳導分子形成一共價鍵。經由該探針與該第一電子傳導分子之間的共價鍵，及該第一電子傳導分子與該電極之間的共價鍵，該探針被附著在該電極上。
    圖3A-圖3F所示為一種用於在一感測器中製備兩個電極來偵測生物分子之方法的例示性具體實施例。在圖3A中，一第一金電極301利用5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩來處理。5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩做為一電子傳導分子，並與第一金電極301形成一第一共價鍵，即可促進處理過的第一金電極301’之電子傳導性。在一些具體實施例中，處理過的第一金電極301’被設置在該感測器的一第一通道中。
    在圖3B中，一第二金電極302利用5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩來處理。5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩做為一電子傳導分子，並與第二金電極302形成一第二共價鍵，即可促進處理過的第二金電極302’之電子傳導性。在一些具體實施例中，處理過的第二金電極302’被設置在該感測器的一第二通道中。
    在圖3C中，一抗(高致癌人類乳突病毒，HPV HR)抗體303利用聯苯-4-甲醛做處理，使得聯苯-4-甲醛結合至抗體303而成為處理過的抗(HPV HR)抗體303’。聯苯-4-甲醛做為一電子傳導分子，此處理過的抗(HPV HR)抗體303’之電子傳導性因此可以被促進。
    在圖3D中，一抗(咖啡因)抗體304利用聯苯-4-甲醛做處理，使得聯苯-4-甲醛結合至抗體304而成為處理過的抗(咖啡因)抗體304’。聯苯-4-甲醛做為一電子傳導分子，此處理過的抗(咖啡因)抗體304’之電子傳導性因此可以被促進。
    在圖3E中，處理過的抗(HPV HR)抗體303’被附著在處理過的第一金電極301’上。在一些具體實施例中，處理過的抗(HPV HR)抗體303’之一胺基可以與5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩形成一第三共價鍵。經由該等第一與第三共價鍵，處理過的抗(HPV HR)抗體303’被附著在處理過的第一金電極301’上。
    在圖3F中，處理過的抗(咖啡因)抗體304’被附著在處理過的第二金電極302’上。在一些具體實施例中，處理過的抗(咖啡因)抗體304’之一胺基可以與5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩形成一第四共價鍵。經由該等第二與第四共價鍵，處理過的抗咖啡因抗體304’被附著在處理過的第二金電極302’上。
    [實施例1]包括兩個電極組之一裸感測器晶片被安裝在感測器上。在該感測器中，一第一流動通道橫跨該第一電極組，而一第二流動通道橫跨該第二電極組。在該感測器被啟動之後，一泵自一緩衝溶液桶汲取磷酸鹽緩衝食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)緩衝液。PBS緩衝液的pH值為7.2，並以20 μl/min的速率流動於該感測器晶片之上。然後一電子傳導分子，10mM的5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩溶液被注射到該感測器樣本迴路內，並利用PBS緩衝液沖流。然後5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩溶液與PBS緩衝液分別流動於該第一電極組與該第二金電極組之上有5分鐘。最後，該第一金電極組與該第二金電極組利用PBS緩衝液沖洗另一15分鐘。
    在PBS緩衝液中配製200 μg/ml單株抗(HPV HR)抗體(英國劍橋Abcam公司的ab75574產品)溶液。將溶於50%乙醇/50%水的10 mM聯苯-4-甲醛，另一電子傳導分子(德國Hohenbrunn之MerckSchuchardt OHG，8.41238.0010)溶液加入至該抗體溶液。在良好混合之後，形成一聯結型的單株抗(HPV HR)抗體溶液。
    在PBS緩衝液中形成200 μg/ml單株抗(咖啡因)抗體(英國劍橋Abcam公司的ab15221產品)溶液。將溶於50%乙醇/50%水的10 mM聯苯-4-甲醛，另一電子傳導分子(德國Hohenbrunn之MerckSchuchardt OHG，8.41238.0010)溶液加入至該抗體溶液。在良好混合之後，形成一結合型單株抗(咖啡因)抗體溶液。
    然後將該結合型單株抗(HPV HR)抗體溶液經由一第一樣本迴路注射到該感測器，然後流動在該第一電極組之上。之後該第一電極組利用PBS緩衝液做沖流。PBS緩衝液的流動速率為20 μl/min進行10分鐘。然後該第一電極組再次利用PBS緩衝液清洗另一10分鐘，其中PBS緩衝液的流動速率被保持在20 μl/min。
    該結合型單株抗(咖啡因)抗體溶液經由一第二樣本迴路注射到該感測器，然後流動在該第二電極組之上。之後該第二電極組利用PBS緩衝液做沖洗。PBS緩衝液的流動速率為20μl/min進行10分鐘。然後該第二電極組再次利用PBS緩衝液清洗另一10分鐘，其中PBS緩衝液的流動速率被保持在20μl/min。
    一感染人類乳突病毒16型(HPV type 16)的病人樣本被稀釋到0.1%、1%、2%、5%與10%。該等被稀釋的樣本被依序注射到該感測器。每一稀釋的樣本同時流動通過該第一電極組與該第二電極組。
    我們重複地使用相同的晶片來研究該病人樣本之每一稀釋的濃度。此係利用酸性甘胺酸緩衝液(0.1 M，pH 2.5)沖洗掉該相關聯的HPV 16來達成。
    來自健康人體之樣本做為一對照組。該對照樣本亦被稀釋成0.1%、1%、2%、5%與10%。該等被稀釋的對照樣本被依序注射到該感測器。每一稀釋的對照樣本同時流動通過該第一電極組與該第二電極組。我們亦使用酸性甘胺酸緩衝液來在兩次注射之間沖洗該晶片。
    由該感測器回應於每次注射所偵測到的電流顯示在圖4A中。在圖4A中，當該病人樣本濃度分別在1%、2%、5%與10%時，對於該感染HPV 16型的病人樣本可偵測到相當高的電流。(點a-點b)/(點c-點d)之電流值的比例用於判定HPV 16型抗原是否存在於該等稀釋的樣本中。
    圖4B為一電極的導電式原子力顯微影像，其中包括聯結有聯苯-4-甲醛的單株抗(HPV HR)抗體，其在施加一偏壓電壓(大約0.01伏特)下由導電式原子力顯微儀所掃描。該影像顯示在該電極之表面上的電傳導性輪廓。X軸的單位為μm，而Y軸的單位為μm。該較明亮部份代表相當高的電傳導性(例如大約99.98奈安培)。該較暗的部份代表相當低的電傳導性(例如大約0奈安培)。
    [實施例2]包括兩個電極組之一裸感測器晶片被安裝在感測器上。在該感測器中，一第一流動通道橫跨該第一電極組，而一第二流動通道橫跨該第二電極組。在該感測器被啟動之後，一泵自一緩衝溶液桶汲取磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)緩衝液。PBS緩衝液的pH值為7.2，並以20 μl/min的速率流動於該感測器晶片之上。然後一電子傳導分子，10mM的5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩溶液經由一樣本迴路被注射到該感測器樣本迴路內，並利用PBS緩衝液沖流。5’然後將5’-(甲基)硫醇-5-甲醛-2,2’-聯噻吩溶液與PBS緩衝液分別流動於該第一電極組與該第二電極組之上有5分鐘。最後，該第一電極組與該第二電極組利用PBS緩衝液沖洗另一15分鐘。
    在PBS緩衝液中配製200 μg/ml單株抗(腸病毒71型,EV 71)抗體(美國麻州Billerica的Millipore，3321)溶液。將溶於50%乙醇/50%水的10 mM聯苯-4-甲醛，另一電子傳導分子(德國Hohenbrunn之MerckSchuchardt OHG，8.41238.0010)溶液加入至該抗體溶液。在良好混合之後，形成一結合型單株抗(EV 71)抗體溶液。
    在PBS緩衝液中形成200 μg/ml單株抗(頂體)抗體(英國劍橋Abcam公司的ab4569產品)溶液。將溶於50%乙醇/50%水的10 mM聯苯-4-甲醛(德國Hohenbrunn之MerckSchuchardt OHG，8.41238.0010)溶液加入至該抗(頂體)抗體溶液。在良好混合之後，形成一結合型抗(頂體)抗體溶液。
    然後該結合型單株抗(EV71)抗體溶液經由一第一樣本迴路注射到該感測器，然後流動在該第一電極組之上。之後該第一電極組利用PBS緩衝液做沖流。PBS緩衝液的流動速率為20 μl/min進行10分鐘。然後該第一電極組再次利用PBS緩衝液清洗另一10分鐘，其中PBS緩衝液的流動速率被保持在20 μl/min。
    該結合型抗(頂體)蛋白質溶液經由一第二樣本迴路注射到該感測器，然後流動在該第二金電極組之上。之後該第二電極組利用PBS緩衝液做沖洗。PBS緩衝液的流動速率為20 μl/min進行10分鐘。然後該第二電極組再次利用PBS緩衝液清洗另一10分鐘，其中PBS緩衝液的流動速率被保持在20 μl/min。
    一感染腸病毒71型(EV 71)的病人樣本被稀釋成0.1%、1%、2%、5%與10%。該等被稀釋的樣本被依序注射到該感測器。每一稀釋的樣本同時流動通過該第一電極組與該第二電極組。
    我們重複地使用相同的晶片來研究該病人樣本之每一稀釋的濃度。此係利用酸性甘胺酸緩衝液(0.1 M，pH 2.5)沖洗掉該相關聯的EV71來達成。
    來自健康人體之樣本做為一對照組。該對照樣本亦被稀釋成0.1%、1%、2%、5%與10%。該等被稀釋的對照樣本被依序注射到該感測器。每一稀釋的對照樣本同時流動通過該第一電極組與該第二電極組。我們亦使用酸性甘胺酸緩衝液來在兩次注射之間沖洗該晶片。
    由該感測器回應於每次注射所偵測到的電流顯示在圖4C中。在圖4C中，當該病人樣本濃度分別在0.1%、1%、2%、5%與10%時，對於該感染EV71的病人樣本可偵測到相當高的電流。(點a-點b)/(點c-點d)之電流值的比例用於判定EV71抗原是否存在於該等稀釋的樣本中。
    [實施例3]包括兩個金電極組之一裸感測器晶片被安裝在感測器上。在該感測器中，一第一流動通道橫跨該第一電極組，而一第二流動通道橫跨該第二電極組。在該感測器被啟動之後，一泵自一緩衝溶液桶汲取磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)緩衝液。PBS緩衝液的pH值為7.2，並以20 μl/min的速率流動在該感測器晶片之上。然後一電子傳導分子，10 mM的對-4'-甲醛-4-羧基-1,1'-聯苯(CHO-(C6H4)2-COOH)溶液經由一樣本迴路被注射到該感測器的樣本迴路內，並利用PBS緩衝液沖洗。然後將對-4'-甲醛-4-羧基-1,1'-聯苯溶液與PBS緩衝液流動在該第一電極組與該第二電極組之上18分鐘。最後，該第一電極組與該第二電極組利用PBS緩衝液沖洗另一15分鐘。然後400 mM的EDC與100 mM的NHS(EDC體積/NHS體積=1/1)的混合物被射入，並以流動速率20 μl/min流動在該感測器晶片上15分鐘。
    在醋酸鹽緩衝液(pH值4.8)形成一200 μg/ml單株抗(白血球化學趨向素-2,Lect2)抗體(美國加州Santa Cruz，Santa Cruz，sc-99036)溶液。將溶於50%乙醇/50%水的10 mM聯苯-4-甲醛，另一電子傳導分子(德國Hohenbrunn之MerckSchuchardt OHG，8.41238.0010)溶液加入至該抗體溶液。在良好混合之後，形成一結合型單株抗(Lect2)抗體溶液。
    在PBS緩衝液中形成200 μg/ml單株抗(頂體)蛋白質(英國劍橋Abcam公司的ab4569產品)溶液。將溶於50%乙醇/50%水的10 mM聯苯-4-甲醛(德國Hohenbrunn之MerckSchuchardt OHG，8.41238.0010)溶液加入至該抗(頂體)蛋白質溶液。在良好混合之後，形成一結合型抗(頂體)蛋白質溶液。
    然後該結合型單株抗(Lect2)抗體溶液經由一第一樣本迴路注射到該感測器，且流動在該第一電極組之上。之後該第一電極組利用PBS緩衝液做沖洗。PBS緩衝液的流動速率為20 μl/min進行10分鐘。然後該第一電極組再次利用PBS緩衝液清洗另一10分鐘，其中PBS緩衝液的流動速率被保持在20 μl/min。
    該結合型抗(頂體)蛋白質溶液經由一第二樣本迴路注射到該感測器，然後流動在該第二電極組之上。然後該第二電極組利用PBS緩衝液做沖洗。PBS緩衝液的流動速率為20 μl/min進行10分鐘。然後該第二電極組再次利用PBS緩衝液清洗另一10分鐘，其中PBS緩衝液的流動速率被保持在20 μl/min。
    包含Lect2生物標記分子之肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)病人樣本被稀釋成0.1%、1%、2%、5%與10%。該等被稀釋的樣本被依序注射到該感測器。該等流動通道開關控制每一稀釋的樣本同時流動通過該第一電極組與該第二電極組。
    我們重複地使用相同的晶片來研究該病人樣本之每一稀釋的濃度。此係利用酸性甘胺酸緩衝液(0.1 M，pH 2.5)沖洗掉該相關聯的Lect2來達成。
    來自健康人體之樣本做為一對照組。該對照樣本亦被稀釋成0.1%、1%、2%、5%與10%。該等被稀釋的對照樣本被依序注射到該感測器。該等流動通道開關控制每一稀釋的對照樣本同時流動通過該第一電極組與該第二電極組。我們亦使用酸性甘胺酸緩衝液來在兩次注射之間沖洗該晶片。
    由該感測器回應於每次注射所偵測到的電流顯示在圖4D中。在圖4D中，當該病人樣本濃度分別在0.1%、1%、2%、5%與10%時，對於包含Lect2生物標記分子的感染肝細胞癌(HCC)的病人樣本可偵測到相當高的電流。(點a-點b)/(點c-點d)之電流值的比例用於判定Lect2抗原是否存在於該等稀釋的樣本中。
    雖然前述本發明為了可清楚瞭解的目的而藉由例示與範例做詳細的說明，本技術專業人士應瞭解到在不背離本發明之精神與範疇之下可以實施某些改變與修正。因此，本說明不應視為限制本發明之範疇。
    針對所有目的及如同每個個別出版物、專利或專利申請案被特定與個別地指明來加入做為參照之相同的程度，將此處所引述之所有出版物、專利與專利申請案在此加入其整體做為參照。
    100．．．感測器
    101．．．緩衝溶液桶
    103．．．泵
    105．．．分流器
    108．．．處理器
    109．．．廢液桶
    111．．．第一通道
    113．．．第二通道
    120．．．生物晶片
    121．．．第一電極組
    122．．．第二電極組
    123、124．．．電路
    130．．．第一樣本迴路
    140．．．第二樣本迴路
    301．．．第一電極
    301’．．．處理過的第一電極
    302．．．第二金電極
    302’．．．處理過的第二金電極
    303．．．抗(HPV HR)抗體
    303’．．．處理過的抗(HPV HR)抗體
    304．．．抗(咖啡因)抗體
    304’．．．處理過的抗(咖啡因)抗體
    圖1為一種用於偵測生物分子的感測器之例示性具體實施例；
    圖2為一種用於偵測生物分子的方法之例示性具體實施例的流程圖；
    圖3A-圖3F為一種用於在一感測器中製備兩個電極來偵測生物分子之方法的例示性具體實施例；
    圖4A為一例示性具體實施例的圖形，所示為由感染人類乳突病毒16型(Human Papilloma virus Type 16，HPV 16)之病人樣本與對照樣本所稀釋出不同濃度下所偵測到的電流；
    圖4B為一電極的導電式原子力顯微影像，其中包括結合有聯苯-4-甲醛的單株抗(HPV HR)抗體，其在施加一偏壓電壓(大約0.01伏特)下由導電式原子力顯微儀所掃描；
    圖4C為一例示性具體實施例的圖形，所示為來自感染腸病毒71型(Enterovirus type 71，EV 71)之病人樣本與對照樣本之不同稀釋濃度下所偵測到的電流；及
    圖4D為一例示性具體實施例的圖形，所示為來自含有衍生自白血球之化學趨向素-2(Leukocyte cell-derived chemotaxin-2,Lect2)之病人樣本與對照樣本之不同稀釋濃度下所偵測到的電流。
    100．．．感測器
    101．．．緩衝溶液桶
    103．．．泵
    105．．．分流器
    108．．．處理器
    109．．．廢液桶
    111．．．第一通道
    113．．．第二通道
    120．．．生物晶片
    121．．．第一電極組
    122．．．第二電極組
    123、124．．．電線
    130．．．第一樣本迴路
    140．．．第二樣本迴路
    权利要求:
    Claims (48)
    [1] 一種用於偵測特定的目標物之感測器，其包含：一第一電極，其包含(i)一第一電子傳導分子；及(ii)一第一探針，其包含一第二電子傳導分子，其中該第一探針配置成來結合存在溶液中該特定的目標物，其中該等第一與第二電子傳導分子不相同。
    [2] 如申請專利範圍第1項之感測器，其中該第一電子傳導分子共價地附著至該第一電極。
    [3] 如申請專利範圍第1項之感測器，其中該第一探針共價地附著至該第一電極。
    [4] 如申請專利範圍第2項之感測器，其中該第一探針共價地附著至該第一電子傳導分子。
    [5] 如申請專利範圍第1項之感測器，另包含一第一流動通道，其接觸於該第一電極，且配置成使得包含該特定的目標物之一樣本流動通過該第一流動通道，並在當該特定的目標物結合至該第一探針時產生一第一信號。
    [6] 如申請專利範圍第5項之感測器，另包含一處理器，其配置來偵測該第一信號。
    [7] 如申請專利範圍第6項之感測器，其中偵測到該第一信號代表該樣本包含該特定的目標物。
    [8] 如申請專利範圍第1項之感測器，另包含一第二電極，其中該第二電極包含一第三電子傳導分子與一第二探針，其中該第二探針不會結合該特定的目標物，且其中該第三電子傳導分子為相同或不相同於該第一或第二電子傳導分子。
    [9] 如申請專利範圍第8項之感測器，其中該第三電子傳導分子相同於該第一電子傳導分子。
    [10] 如申請專利範圍第8項之感測器，其中該第三電子傳導分子共價地附著至該第二電極。
    [11] 如申請專利範圍第8項之感測器，其中該第二探針包含一第四電子傳導分子，其中該第四電子傳導分子相同或不同於該第三電子傳導分子。
    [12] 如申請專利範圍第11項之感測器，其中該第四電子傳導分子相同於該第二電子傳導分子。
    [13] 如申請專利範圍第10項之感測器，其中該第二探針共價地附著至該第三電子傳導分子。
    [14] 如申請專利範圍第11項之感測器，其中該第三電子傳導分子共價地附著至該第二電極，且其中該第二探針共價地附著至該第三電子傳導分子。
    [15] 如申請專利範圍第8項之感測器，另包含一第一流動通道，其接觸於該第一電極，並配置成使得包含該特定的目標物之一樣本流動通過該第一流動通道，並在當該目標物結合至該第一探針時產生一第一信號，且另包含一第二流動通道，其接觸於該第二電極，並配置成使得該樣本流動通過該第二流動通道，並產生一第二信號。
    [16] 如申請專利範圍第15項之感測器，另包含一處理器，其配置來偵測該第一信號與該第二信號。
    [17] 如申請專利範圍第16項之感測器，其中該特定的目標物藉由比較關聯於該等第一與第二信號之數值與一預定值來進行偵測，其中該數值大於該預定值代表該特定的目標物存在於該樣本中。
    [18] 如申請專利範圍第1項之感測器，其中該等第一與第二電子傳導分子為由一芳香族化合物、一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一噻吩化合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物中選出的不同分子。
    [19] 如申請專利範圍第8項之感測器，其中該第三電子傳導分子為一芳香族化合物、一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一噻吩化合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物。
    [20] 如申請專利範圍第11項之感測器，其中該第四電子傳導分子為一芳香族化合物、一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一噻吩化合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物。
    [21] 如申請專利範圍第1項之感測器，其中該第一探針為DNA、RNA、一蛋白質、一抗體、包含有能力來結合於該生物分子的一抗體片段、一適體、一抗原或一抗原決定部位。
    [22] 如申請專利範圍第8項之感測器，其中該第二探針為DNA、RNA、一蛋白質、一抗體、包含有能力來結合於該生物分子的一抗體片段、一適體、一抗原或一酵素。
    [23] 一種用於偵測特定的目標物之方法，該方法包含：將一感測器接觸於包含該目標物的一樣本，其中該感測器包含一第一電極，其包含(i)一第一電子傳導分子；及(ii)一第一探針，其包含一第二電子傳導分子，其中該第一探針配置成來結合至該目標物，且其中該等第一與第二電子傳導分子並不相同，其中當該目標物結合至該第一探針時即產生一第一信號，及，其中偵測到該第一信號代表該目標物存在於該樣本中。
    [24] 如申請專利範圍第23項之方法，另包含引入該樣本到一第一流動通道中，使得該樣本流動通過該第一流動通道，並接觸於該第一電極，其中該第一信號在該第一流動通道中產生。
    [25] 如申請專利範圍第23項之方法，其中該第一電子傳導分子共價地附著至該第一電極。
    [26] 如申請專利範圍第23項之方法，其中該第一探針共價地附著至該第一電極。
    [27] 如申請專利範圍第25項之方法，其中該第一探針共價地附著至該第一電子傳導分子。
    [28] 如申請專利範圍第24項之方法，其中該感測器另包含一處理器，其配置來偵測該第一信號。
    [29] 如申請專利範圍第23項之方法，其中該感測器包含一第二電極，其中該第二電極包含一第三電子傳導分子與一第二探針，其中該第二探針不會結合該目標物，且其中該第三電子傳導分子為相同或不相同於該第一或第二電子傳導分子。
    [30] 如申請專利範圍第29項之方法，其中該第三電子傳導分子相同於該第一電子傳導分子。
    [31] 如申請專利範圍第29項之方法，其中該第三電子傳導分子共價地附著至該第二電極。
    [32] 如申請專利範圍第29項之方法，其中該第二探針包含一第四電子傳導分子，其中該第四電子傳導分子相同或不同於該第三電子傳導分子。
    [33] 如申請專利範圍第32項之方法，其中該第四電子傳導分子相同於該第二電子傳導分子。
    [34] 如申請專利範圍第31項之方法，其中該第二探針共價地附著至該第三電子傳導分子。
    [35] 如申請專利範圍第32項之方法，其中該第三電子傳導分子共價地附著至該第二電極，且其中該第二探針共價地附著至該第三電子傳導分子。
    [36] 如申請專利範圍第29項之方法，其中該感測器另包含一第一流動通道，其接觸於該第一電極，且配置成使得該樣本流動通過該第一流動通道，且該第一信號在該第一流動通道中產生，且其中該感測器另包含一第二流動通道，其接觸於該第二電極，且配置成使得該樣本流動通過該第二流動通道，並產生一第二信號。
    [37] 如申請專利範圍第36項之方法，其中該感測器另包含一處理器，其配置來偵測該第一信號與該第二信號。
    [38] 如申請專利範圍第37項之方法，其中該目標物藉由比較關聯於該等第一與第二信號之數值與代表該特定的目標物存在於該樣本中的一預定值來進行偵測。
    [39] 如申請專利範圍第23項之方法，其中該等第一與第二電子傳導分子為由一芳香族化合物、一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一噻吩化合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物中選出的不同分子。
    [40] 如申請專利範圍第29項之方法，其中該第三電子傳導分子為一芳香族化合物、一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一噻吩化合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物。
    [41] 如申請專利範圍第32項之方法，其中該第四電子傳導分子為一芳香族化合物、一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一噻吩化合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物。
    [42] 如申請專利範圍第23項之方法，其中該第一探針為DNA、RNA、一蛋白質、一抗體、包含有能力來結合於該生物分子的一抗體片段、一適體、一抗原或一抗原決定部位。
    [43] 如申請專利範圍第29項之方法，其中該第二探針為DNA、RNA、一蛋白質、一抗體、包含有能力來結合於該生物分子的一抗體片段、一適體、一抗原或一抗原決定部位。
    [44] 一種結合由一吡啶化合物、一聚乙炔聚合物、一唑類化合物、一聚苯胺聚合物或其衍生物中選出的一電子傳導分子的感測器探針，其中該探針配置成來結合一特定的目標物。
    [45] 如申請專利範圍第44項之感測器探針，其中該探針共價地附著該電子傳導分子，其配置成與一電極形成一第二共價鍵。
    [46] 如申請專利範圍第44項之感測器探針，其中該探針為DNA、RNA、一蛋白質、一抗體、包含有能力來結合於該特定的生物分子的一抗體片段、一適體、一抗原或一抗原決定部位。
    [47] 一種包含如申請專利範圍第44項之感測器探針的電極。
    [48] 如申請專利範圍第47項之電極，其中該探針共價地附著至該電子傳導分子，且其中該電子傳導分子共價地附著至該電極。
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    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    US13/165,464|US8877022B2|2011-06-21|2011-06-21|Biosensor|
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